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本试剂采用稳定高效的RT-PCR预混体系，是以RNA为模板进行一步法RT-PCR的专用试剂。其原理为用基因特异性引物进行反转录反应，获得第一链cDNA（不可使用Oligo（dT）或Random Rimer合成第一链cDNA），再使用基因特异性正向引物和反向引物进行PCR扩增，在同一反应体系中一步完成从反转录到PCR的全部过程。反应体系中已含有电泳所需的指试剂（蓝色和黄色），反应后可以直接进行电泳。

在本试剂盒中，将耐热M-MLV反转录酶、Rnase Inhibitor、Hotstart高保真DNA聚合酶以及稳定剂等配制成50×One-Step Enzyme Mix预混液；反应Buffer、dNTP以及电泳指示染料配制成5×HiFi One-Step RT-PCR Buffer，因此使得操作更加简单便，扩增产物可用于平端克隆和DNA测序。

• 耐热M-MLV反转录酶可在55℃反应能更好的打开复杂二级结构，只需10min即可完成逆转录。
  
• DNA聚合酶为热启动型高保真酶，能够有效的抑制非特异性反应且具有较高的校正活性，酶激活仅需2min。
  
• 具有宽泛的模板量兼容性，10ng～1μg都可有效扩增。
  
• 反应过程中无需开盖，避免了操作过程中的污染危害。

• 50×One-Step Enzyme Mix粘度高，第一次使用之前要离心收集至反应管底部，吸取时应缓慢小心。
  
• 由于使用了Hotstart高保真DNA聚合酶，反应配制可在常温进行，但各组分应-20℃保存。

• 按以下成分配制反应液：
  

  成分	用量
  RNA（病毒DNA/RNA样品直接使用2～10μL）	10ng～1μg
  5×HiFi One-Step RT-PCR Buffer	4μL
  50×HiFi One-Step RT-PCR Enzyme Mix	0.4μL
  基因特异性上游引物（10μM）	0.8μL
  基因特异性下游引物（10μM）	0.8μL
  RNase-Free H2O	至20μL

  • 超过1μg的RNA模板量会抑制PCR反应，建议第一次可使用200ng的RNA模板，然后根据结果进行优化。
• 在PCR仪上按以下条件进行RT-PCR反应：
  

  温度	时间	说明
  55℃	10min	逆转录反应
  95℃	2min	失活M-MLV，并激活高保真聚合酶
  95℃	20s	30～40个循环
  TM温度	20s
  72℃	2kb/min
  72℃	2min	末端延伸

• PCR反应结束后，可取5μL产物直接进行电泳检测。
  
  • 预混液中已经包含绿色染料，无需再加入DNA Loading Buffer。
    
  • 1% Agarose电泳时，蓝色指示剂指示3～5kb，黄色指示剂指示<50bp。